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簡要描述：DNA片段的克隆需要合適的載體，載體或是質(zhì)粒，或是噬菌體，或是病毒，通常大多經(jīng)過人工改造。作為載體必須具備兩條件：一是該載體在細(xì)胞內(nèi)必須能自主復(fù)制，即必須具備復(fù)制原點(diǎn)；二是該載體必須具備適合的酶切位點(diǎn)，且這些酶切位點(diǎn)不在復(fù)制原點(diǎn)區(qū)域內(nèi)。以上兩條，保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便于獲得陽隆克隆，載體上常有篩選標(biāo)記，如對抗菌素的抗性，某些基因產(chǎn)物的顯色反應(yīng)等。
更新時間：2024-10-26 00:00:00
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一、分子克隆與質(zhì)粒載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)Molecular cloning 服務(wù)介紹
分子克隆是在分子水平上提供一種純化和擴(kuò)增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，引入適合的寄主體內(nèi)得到復(fù)制與擴(kuò)增，然后再從篩選的寄主細(xì)胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴(kuò)增。
二、分子克隆與質(zhì)粒載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)Molecular cloning 實(shí)驗(yàn)原理
外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2%2B、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有—種大腸桿菌連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。
T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分為3步：先，T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶—AMP復(fù)合物；然后，酶—AMP復(fù)合物再結(jié)合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；后產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。
DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過(牛小腸堿性磷酸酶)CIP處理克服。
連接反應(yīng)的溫度在37℃時有利于連接酶的活性.但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此人們找到了一個折中溫度，即12-16℃，連接12-16h(過夜)，這樣既可大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。
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